Являются ли интроны столь же древними, как первичные кодирующие участки, или же они появились в ходе последующей эволюции? В семействе генов гормона роста и в других мультигенных семействах положение и число интронов одинаково как для пара, так и для ортологичных генов, хотя их длина и нуклеотидная последовательность варьируют. Это согласуется с предположением, что участки, прерывающие гены, имеют столь же древнее происхождение, как и большинство самих предковых генов, но они сравнительно независимы от давления отбора. Об этом свидетельствуют, например, данные о структуре генов инсулина млекопитающих. Как правило, в гаплоидном геноме позвоночных присутствует единственный ген инсулина с двумя интронами. Однако у некоторых грызунов имеется второй функционально активный ген инсулина с единственным интроном. Проще предположить, что второй ген появился в результате случайной дупликации исходного гена и потери интрона, чем считать, что в предковом гене у всех позвоночных имелся только один интрон. Такие же доводы можно привести и в случае семейства глобиновых генов, которое описано ниже. У растений в генах леггемоглобина имеются три интрона, два из которых расположены так же, как интроны в генах гемоглобина позвоночных. Положение интронов в глобиновых генах иллюстрирует еще одну общую закономерность: экзоны часто кодируют определенные структурные и функциональные домены белков. Все эти факты свидетельствуют о том, что интроны присутствовали уже в самых первых генах. Однако наличие интронов на ранних этапах эволюции не означает, что они не могли внедряться в уже существующие кодирующие области. Возможно, именно таков механизм появления некоторых интронов в генах семейства серии - новых протеаз (например, тромбина, трипсина и химотрипсина). Недавние эксперименты позволили построить модели встраивания интронов. Так, интроны I и II групп внедряются в сайты-мишени с помощью генной конверсии или обратного самосплайсинга. Конверсия генов I группы зависит от белков, которые кодируются интроном.