При встраивании в эти векторы экзогенной ДНК обычно из фаговой ДНК удаляются фрагменты, в состав которых входят трансдуцируемые этим фагом бактериальные гены. Гибриды выявля­ются на соответствующих мутантных бактери­альных клетках как фаги, утратившие бактери­альный ген и поэтому уже не комплементирующие мутацию в клетке-хозяине. Ко второму поколению векторов замещения относятся фаги Я, у которых замещаемые фраг­менты ДНК с двух сторон ограничены искусст­венными полилинкерами, содержащими участ­ки узнавания различных рестриктаз. Широкое применение получили фаги серии AEMBL. В ряде случаев более удобен фагЯСЬ40, который имеет в полилинкерах участки узнава­ния 16 различных рестриктаз. Замещаемый в геноме этого фага фрагмент состоит из 80 ко­пий участка длиной 235 пн, являющегося 5-концевой частью гена lacZ и имеющего сай­ты узнавания рестриктаз Nael и Хта. Фаг ЯСЬ40 на соответствующих штаммах Е. coli обусловливает комплементацию 3-галактозидазы.  Гибридные фаги, полученные на основе данного вектора, форми­руют бесцветные бляшки. В составе векторов можно клонировать фрагменты ДНК размером до 23 тпн, что обусловило их исполь­зование при создании так называемых библио­тек генов, или клонотек (геномных библиотек). Для формирования библиотеки генов какого - либо организма в векторные ДНК встраивают полученные случайным образом крупные фраг­менты изучаемого генома. Расщепление препа­рата высокомолекулярной ДНК на большие вза­имно перекрывающиеся фрагменты осуществ­ляют чаще всего путем частичного гидролиза мелкощепящей рестриктазой (обычно 5аиЗА1 или Mbol). Фрагментация также возможна с по­мощью физических методов. Для избавления от неспецифического фона (встройка в вектор двух или более несоседних на геноме фрагментов) гидролизат ДНК подвергают фракционирова­нию по размеру и в реакцию лигирования вво­дят фрагменты протяженностью 15-20 тпн, с тем чтобы в векторную ДНК фага Я мог встро­иться только один фрагмент. При встройке двух и более фрагментов размер гибридной ДНК бу­дет превышать предельно допустимый. Важным свойством этой экспериментальной системы является то, что при упаковке в капсид in vitro происходит отбор гибридных молекул фаговой ДНК определенного размера (от 38 до 51 тпн). Другой подход предполагает дефосфорилирование фрагментированной геномной ДНК с кон­цов с помощью фосфатазы. Такие фрагменты не способны лигироваться между собой, но встраи­ваются в векторную ДНК, имеющую нормаль­ные фосфорилированные 5-концы. В этом слу­чае нет необходимости во фракционировании препарата клонируемой ДНК по размерам.