В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с после­дующей иммунодетекцией. Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесен­ную на подложку, - дот-блот анализ - либо после ее предвари­тельного фракционирования методами электро­фокусирования, диск-электрофореза или дву­мерного электрофореза - Вестерн-блот ана­лиз (Western blotting). Такая методология при­меняется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продук­ты целевых клонированных генов. Перенос белков на мембрану осуществляется либо пас­сивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факто­ров, таких как молекулярная масса белков, по­ристость геля, время переноса и состав исполь­зуемого буферного раствора (транс-буфера). В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты. В качестве подложек обычно используют нитроцеллюлозные, поливинилидендифлуоридные (ПВДФ) или положительно заряженные нейлоновые мембраны. Нитроцеллюлоза может связывать до 80 - 100 мкг белка на 1 см2. Низкомолекулярные белки (с молекулярной массой менее 20 кДа) могут быть утеряны в результате промывок ет возможность предварительно исследовать полиморфизм определенных генетических локусов по длинам соответствующих рестрикционных фрагментов ДНК. Кроме того, с по­мощью гибридизации по Саузерну можно легко выяснить, имеет ли целевой ген участок гид­ролиза определенной рестриктазой в своей внутренней части, что позволяет выбирать оп­тимальную стратегию клонирования изучаемо­го района генома. По аналогичной схеме из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр можно перенести и молекулы РНК. Этот метод был назван Север­ным блоттингом (Northern blotting) в противо­положность блоттингу по Саузерну (Southern blotting), так как фамилия Саузерн в английском языке означает «южный». Перенос на фильтры из геля белков соответственно назвали Запад­ным блоттингом (Western blotting). Крупные белки (более 100 кДа), денатурированные в растворе додецилсульфата натрия (SDS), могут слабо перено­ситься на мембрану, если в транс-буфере при­сутствует этанол. Спирт значительно улучшает перенос белков с SDS-полиакриламидного геля, но сужает поры в геле, что и приводит к задерж­ке крупных белков. Мембрана ПВДФ оптими­зирована для проведения иммунодетекции и способна удерживать специфически связавшие­ся белки до 160 мкг/см2 при очень низком уровне неспецифического связывания. Немаловажное свойство этой мембраны - возможность ее мно­гократного использования. Нейлоновые мембра­ны Zeta-Probe эффективно связывают SDS-белки в отсутствие спирта, причем это связывание устойчиво к последующим обработкам. Низко­молекулярные белки также удерживаются эф­фективно. Благодаря высокой связывающей ем­кости - около 480 мкг белка на 1 см2 - мембра­ны Zeta-Probe позволяют обнаруживать следо­вые количества белка в анализируемых смесях. После того как антиген оказывается иммо­билизованным на мембране, оставшиеся цент­ры связывания блокируют растворами желати­на, либо бычьего сывороточного альбумина, либо обезжиренного молока. Затем мембрану инкубируют в растворе поликлональных или моноклональных антител к исследуемому анти­гену. После отмывки несвязавшихся антител мембрану инкубируют в растворе вторичных антител, которые представляют собой конъюгат ферментов щелочной фосфатазы (alkaline phos­phatase, АР) или пероксидазы хрена (horseradish peroxidase, HRP) с антивидовыми антителами (козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, мыши или человека) либо белками А (белок Sta­phylococcus aureus) или G (белок Streptococcus sp.), имеющими высокую аффинность к Fc-об - ласти иммуноглобулинов. Детекцию образован­ных иммунных комплексов проводят химиче­ским или хемилюминесцентным способом. Субстратами для химической реакции при использовании конъюгатов щелочной фосфа­тазы служат 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP) или тетразолий голубой (NBT), а при ис­пользовании конъюгатов пероксидазы хрена - 4-хлор-1-нафтол и перекись водорода. В резуль­тате ферментативных реакций на мембране об­разуется окрашенная полоса или пятно в месте локализации комплекса антиген-антитело. Чувствительность данного метода составляет 100 пг белка при использовании конъюгатов АР и 100-500 пг при использовании конъюгатов
HRP. Хемилюминесцентная детекция иммунных комплексов позволяет определять менее 5 пг антигена. Принцип этого метода заключается в том, что при реакции HRP с перекисью во­дорода и циклическим диацилгидразинлюминолом происходит эмиссия света длиной волны 428 нм, которая может быть зафиксирована на светочувствительной пленке.