Появление мето­да ПЦР значительно упростило процедуру точ­ного извлечения из состава молекул ДНК из­вестных нуклеотидных последовательностей и встройки их в молекулярные векторы. Могут быть рассчитаны последовательности олиго­нуклеотидных праймеров, которые обеспечива­ют не только точную амплификацию требуемо­го фрагмента, но и одновременно позволяют вводить участки гидролиза определенных рест­риктаз, необходимые для запланиро­ванной встройки в клонирующий вектор. При этом количество исходной ДНК, содержащей це­левую последовательность, может быть очень малым. Олигонуклеотидные микрочипы. В 1988 г. группой ученых института молекулярной био­логии им. В. А. Энгельгардта РАН, руководимой А. Д. Мирзабековым, была инициирована раз­работка олигонуклеотидных микрочипов (micro­chip), иначе называемых олигонуклеотидными микроматрицами (microarray). Целью этого ис­следования была разработка метода, позволяю­щего секвенировать короткие фрагменты ДНК путем гибридизации с олигонуклеотидами из­вестной последовательности, которые иммоби­лизованы на твердом носителе в строго опреде­ленном порядке (это и называется микроматри­цей или микрочипом). В дальнейшем благодаря созданию специ­ального оборудования удалось роботизировать процесс получения микрочипов с нанесением в строго определенном порядке микроколичеств олигонуклеотидов или фрагментов ДНК (кДНК) на твердый носитель (обычно исполь­зуют стекло, нейлоновые мембраны, силиконо­вые поверхности и др.). Это позволило созда­вать микроматрицы, содержащие на поверхнос­ти в несколько квадратных сантиметров сотни и тысячи индивидуальных проб для последую­щей гибридизации. Препараты ДНК, предназ­наченные для гибридизации на микрочипе, флуоресцентно метят, обычно в процессе ПЦР. После гибридизации и отмывки микрочип ана­лизируют с помощью лазерного сканера и дан­ные флуоресценции каждой ячейки микромат­рицы подвергают компьютерной обработке, ис­пользуя специальное программное обеспечение. Секвенирование многочисленных кДНК и полных геномов все расширяющегося спектра организмов создало базу для получения мик­рочипов, позволяющих одновременно изучать экспрессию большого числа генов на уровне це­лого генома. Первую работу данного направ­ления выполнили М, Шен с сотрудниками, создав микрочип на основе амплифицированных в ПЦР фрагментов кДНК для 48 ге­нов растения Arabidopsis thaliana. Из листьев и корней растений выделяли суммарную мРНК, флуоресцентно метили в реакции обратной транскрипции и гибридизовали с созданным микрочипом. Результаты анализа продемонст­рировали, что экспрессия изученных генов в листьях и корнях одного и того же растения различается. В дальнейшем различается были созданы микроматрицы с нанесенными в строгом поряд­ке образцами ПЦР-фрагментов кДНК для сотен и тысяч известных генов человека и других ор­ганизмов. Часто создают специализированные микроматрицы для анализа экспрессии опреде­ленных типов генов; контролирующих клеточ­ный цикл, апоптоз, сплайсинг, трансляцию, синтез цитокинов, комплемента, факторов свер­тывания крови, факторов транскрипции и др. Например, Т. Шенк с сотрудниками, ис­пользуя четыре микрочипа, содержащих в сум­ме фрагменты кДНК для 6600 генов человека, изучили на первичной культуре фибробластов кожи человека, как инфицирование цитомегаловирусом человека влияет на экспрессию этих генов. Оказалось, что данная вирусная инфек­ция достоверно изменяет (увеличивает или уменьшает) экспрессию 258 генов. Другая группа ученых на основе данных секвенирования ДНК цитомегаловируса чело­века создала в 1999 г. микрочип, используя фрагменты длиной 75 нуклеотидов, соответст­вующие всем теоретически предсказанным от­крытым рамкам трансляции. Для 151 вирусной ОРТ была доказана продукция специфических мРНК и выявлено время их биосинтеза в про­цессе инфекции. С. Гуера с соавторами с помощью микроматриц, содержащих 15 тыс. кДНК чело­века, изучили картину изменения экспрессии генов перевиваемой линии клеток человека HeLa в процессе инфекции их вирусом осповакцины. Было обнаружено, что вирусная ин­фекция приводит к активации экспрессии 66 ге­нов клетки и к репрессии 1267 генов. Используя синхронизованную линию фиб­робластов из эмбриона мыши, С. Ишида с соав­торами идентифицировали 188 генов, участвующих в регуляции разных этапов кле­точного цикла. Показ