Хотя ЭДТА-лизоцимные сферопласты Е. co­li в некоторых экспериментах могут обеспечи­вать высокую эффективность трансфекции фа­говыми ДНК (до 10 3 БОЕ на молекулу ДНК фага А), процесс их получения многостадиен и дает плохо воспроизводимые результаты. По­этому данный методический подход не нашел широкого применения. Начиная с 1970 г. его почти полностью вытеснил метод зависимой трансфекции клеток Е. coli, который раз­работали М. Мандель и А. Хига. Они обнару­жили, что обработка культуры Е. coli раствором СаСЬ на холоде (0 °С) с последующим тепло­вым шоком (37 °С) приводит к поглощению клетками добавленных в среду молекул ДНК фага А и завершается образованием инфекцион­ного фагового потомства. Метод оказался край­не простым и воспроизводимым. Наиболее эф­фективно компетентность индуцируется в ак­тивно делящихся клетках Е. coli. Разработан ряд модификаций данного метода, повышаю­щих эффективность трансфекции клеток фаго­выми ДНК. Метод трансфекции, зависимой от катионов кальция, имеет несколько меньшую эффектив­ность (до 10 4 БОЕ на молекулу ДНК фага А), чем метод с использованием сферопластов, од­нако он гораздо проще и дает хорошо воспро­изводимые результаты. Необходимо отметить, что СаСЬ-зависимая трансфекция успешно осу­ществляется лишь на ограниченном числе изу­ченных штаммов Е. coli, а на ее эффективность существенно влияет генотип клетки. Например, у Е. coli К12 делеция галактозного оперона при­водит к удалению галактозы из липополисахаридной оболочки и значительно усиливает спо­собность штаммов к трансфекции ДНК фага А; мутация endA вызывает исчезновение пери - плазматической эндонуклеазы, что сущест­венно повышает сохранность натнвной струк­туры проникающих в клетки молекул ДНК. Небольшие модификации, введенные в 1972 г. С. Коэном с сотрудниками в описан­ную методику, позволили осуществить транс­формацию клеток, обработанных хлоридом кальция, плазмидными ДНК. При этом компе­тентность индуцировалась лишь у 0,1-1 кле­ток культуры Е. coli. Дальнейшие исследования показали, что частоту плазмидной трансформа­ции можно повысить разными способами: под­вергая смесь обработанных СаС1г клеток и ДНК тепловому шоку (42 °С); вводя в эту смесь мо­новалентные катионы; обрабатывая клетки до­полнительно органическими растворителями, сульфгидрильными реагентами; выращивая клетки в среде с повышенным содержанием Mg2+ и др. Кропотливая систематическая рабо­та по подбору штаммов и модификации «каль­циевой» методики позволяет в ряде случаев повышать частоту плазмидной трансформации с 10-5 до 10-3 трансформантов на молекулу плаз­миды. Механизм индукции компетентного состоя­ния клеток Е. coli, обусловленной ионами каль­ция, наиболее подробно был исследован на при­мере плазмидной трансформации. Выяснилось, что в этом процессе критическую роль играет состояние липидов внешней мембраны клеток. Ионы Са2+ (в меньшей степени Ва2+ и Mg2+) мо­гут индуцировать фазовый переход липидов мембраны, благодаря чему она приобретает вместо обычной двухслойной необычную гек­сагональную конфигурацию. Причем данный фазовый переход происходит во время темпера­турного шока обработанных хлоридом кальция клеток и сопровождается поглощением экзоген­ных двухцепочечных молекул ДНК. Темпера­тура фазового перехода строго зависит от липидного состава мембраны. На одном из штам­мов Е. coli было показано, что при тепловом шоке, вызванном переносом обработанных СаС1г клеток с температуры 0 °С на 42 °С, по­глощение молекул ДНК продолжается в тече­ние лишь 20 с. Если после этого смесь клеток и ДНК снова резко охладить до температуры 0 °С, то в процессе индуцируемого фазового перехода липидов молекулы ДНК снова могут проникать в клетки. При этом период проник­новения ДНК более продолжителен. Фазовые переходы липидов приводят к нарушению структуры внешней мембраны, но практически не затрагивают плазматическую мембрану кле­ток Е. coli. Необходимо отметить, что через плазматическую мембрану молекулы ДНК спо­собны проникать без теплового шока и бива­лентных катионов, как это происходит у сферо - пластов, у которых отсутствует барьер внешней мембраны для макромолекул.