Посколь­ку клетки Е. coli, обладающие системой рест­рикции-модификации EcoRl, пермиссивны для фага А, именно для рестриктазы ЕсоШ были получены первые векторные фаги А. Это обус­ловлено тем, что мутанты фага А по местам действия рестриктазы EcoRl можно достаточно просто получать и отбирать в системе in vivo. Схема данного подхода состоит в следующем. Фагом А попеременно инфицируют клетки Е. coli, имеющие систему рестрикции-модифи­кации? coRI и не имеющие таковой. Возникаю­щие спонтанно или в результате мутагенеза му­танты, потерявшие некоторые из участков дейст­вия рестриктазы, имеют селективное преимуще­ство перед исходным фагом при размножении на штамме с системой рестрикциимодификации, так как мутантный фаг с большей вероятностью выживает на рестриктирующем штамме за счет конкурентной модификации имеющихся на ДНК мест рестрикции. Г. А. Щелкуновой и С. Н. Щелкуновым по­казано, что среднее ограничение фага A in vivo системой рестрикции-модификации ? coRI по каждому из пяти участков воздействия на фаго­вую ДНК составляет 5,6. У
мутантного вариан­та, имеющего лишь три EcoRI-участка, при ин­фицировании рестриктирующего штамма Е. co­li будет выживать и давать начало фаговому потомству одна молекула ДНК из 180. Для фага дикого типа (пять iicoRI-участков) это соотно­шение будет 1 из 5,5 тыс. молекул. Фаговое по­томство, полученное на штамме с R-М-системой, имеет метилированную ДНК. Для того чтобы снять эту модификацию, популяцию фа­гов с рестриктирующего штамма пассируют на штамме без системы рестрикциимодификации и затем снова проводят через рестриктирующий штамм. После нескольких таких циклов мутанты фага по местам действия рестриктазы в силу своего селективного преимущества вы­тесняют из популяции исходный фаг. По такой схеме были получены первые век­торные фаги А для клонирования fcoRI-фрагментов. Для конст­руирования векторов, содержащих участки гид­ролиза другими рестриктазами, такой подход не­приемлем, так как фаг Я не способен размно­жаться на бактериях, обладающих соответст­вующими системами рестрикции-модификации. В этом случае возможны другие методы созда­ния векторных ДНК. Так, для рестриктазы Hindlll вектор был получен путем рекомбинационной замены сегмента ДНК фага Я, содержаще­го shnk 6, на гомологичную область ДНК близко­родственного лямбдоидного фага 080, не имею­щую места гидролиза. Необходимо отметить, что жизнеспособ­ность вариантов фага Я резко снижается, когда размер их генома составляет более 105 или ме­нее 78 генома фага дикого типа. Поэтому каждый конкретный векторный фаг имеет огра­ничения по размеру фрагментов ДНК, которые можно в нем клонировать. Суммарный размер ДНК гибридных фагов должен находиться в ин­тервале 38-51 тпн. Существующие в настоящее время вектор­ные фаги Я для каждой конкретной рестриктазы делят на векторы внедрения и векторы замеще­ния. Векторы внедрения имеют на ДНК одно место действия для данной рестриктазы. Если при встройке экзогенного фрагмента ДНК в этот сайт происходит нарушение какого-либо гена исходного фага, селекция гибридных кло­нов осуществляется как выявление соответст­вующих фаговых мутантов. Рассмотрим типич­ных представителей этой группы векторов. Первый Я-вектор внедрения был получен в лаборатории Н. Муррея на основе делеционного фага . Вставка фраг­мента ДНК в srlA3 повреждает ген redo, этого фага, давая потомство с фенотипом Red.