Клетки с мутацией по гену lacl, ведущей к образованию дефектных молекул репрессора, осуществляют конститутивную (нерегулируе­мую) транскрипцию асоперона. Мутанты laclQ характеризуются сверхсинтезом белка-репрессора. Присутствие больших количеств ас репрессора препятствует полной экспрессии генов lac - оперона даже при наличии индуктора ИПТГ. Ис­пользование клетки-хозяина с мутацией laclQ позволяет эффективно регулировать транскрип­цию с промотора р 1ас. В обычных условиях в Е. coli acIQ транскрипция с данного промо­тора практически не происходит, но в нужный момент она может быть индуцирована добавле­нием в среду ИПТГ. Наибольший интерес для молекулярных биологов в lac-опероне представляет ген lacL. Продукт этого гена - 3-галактозидаза (уЗ-Gal) - легко определяется по специфической фермен­тативной активности. Более того, данный фермент обладает рядом уникальных свойств. В 1968 г. была описана так называемая «-комплементация 3-галактозидазы, которая относится к внутрицистронной (внутригенной) комплементации и состоит в том, что в резуль­тате нековалентной ассоциации различных мутантных форм или фрагментов одного и того же белка образуется функционально активный бе­лок. Полипептид состоит из 1021 амино­кислотного остатка. Ферментативной актив­ностью обладает белок, состоящий из четырех идентичных субъединиц (тетрамер с суммар­ной молекулярной массой 460 кДа). При изу­чении различных мутантов по гену lacL были выявлены неактивные формы галактозидазы, обозначенные М15иМ112и имеющие соответ­ственно делеции аминокислот с 11-й по 41-ю (Д11-41 АК) и с 23-й по 31-ю (А23-31 АК). Ока­залось, что эти мутантные белки не образуют тетрамерной структуры, а являются димерами. Более того, было обнаружено, что если к препа­рату З-Gal Ml5 или Ml 12 добавить пептид 3-92 АК, получаемый после гидролиза 3-галактозидазы бромистым цианом (гидролизует белки по метиониновым остаткам), то происходит ком­плементация и ферментативная активность вос­станавливается. Такой фермент, подобно нативному, имеет тетрамерную структуру. Неактив­ные белки с делецией в N-концевой последова­тельности З-Gal получили название «-акцепто­ры, а комплементирующие их пептиды или му­тантные формы белка - «-доноры. В более поздних исследованиях было показано, что пеп­тид 3-41 АК также является полностью актив­ным «-донором по отношению к/З-Gal Ml5. Отобранный на среде с Xgal гибридный фаг, синтезирующий «донор 3-галактозидазы, обо­значили M13mpl. Однако этот фаг еще нельзя было использовать в качестве векторного, так как в нем отсутствовали единичные места гид­ролиза рестриктазами в межгенной области. Поэтому была предпринята попытка сформи­ровать рестрикционный участок, используя му­тагены, специфично действующие на одноцепочечную ДНК. Последовательность, узнаваемую рестриктазой EcoRl, удалось создать, заменив гуанин в положении 13 структурного гена lacZ, на аденин. Такую замену осуществили с по­мощью алкилирующего агента N-метил-М-нит - розомочевины. Метилирование этим мутагеном гуанина по положению О6 обусловливает при репликации ДНК ошибочное спаривание, при­водящее к замене в фаговом потомстве модифи­цированного гуанина на аденин. После мутагенеза ДНК трансфицировали в клетки Е. coli и индивидуальные фаговые кло­ны подвергали проверке на наличие coRI-Mec - та на РФ фаговой ДНК. В результате был выде­лен мутантный фаг М13тр2, имеющий участок узнавания рестриктазы EcoRl . У этого фага в аминокислотной последователь­ности синтезируемого фрагмента 3-галактози - дазы в пятом положении произошла замена ас - парагиновой кислоты на аспарагин. При этом а-комплементация /3-GalM15 не нарушилась, так как данная область «-донора для компле­ментации несущественна. Для расширения возможностей клонирова­ния фрагментов в ДНК векторного фага М13шр2 по ? соЯ1-месту встроили синтетический поли­линкер, который содержит по два сайта дейст­вия рестриктаз EcoRl, ВатШ, Sail, Accl иHindi, расположенных симметрично относи­тельно центрального участка действия рестрик­тазы Pstl. Полученный вариант фага обозначен М13тр7 (рис. 2.30). Встройка данного поли­линкера в фаг М13тр2 не нарушила рамку трансляции донора, а следовательно, и обус­ловливаемую фагом комплементацию, что позволяет широко использовать сконструиро­ванный фаг в экспериментах по клонированию фрагментов ДНК. Путем замены последова­тельности синтетических линкеров достаточно просто созданы разнообразные векторные про­изводные фага.