По рассмотренной схеме под контролем раз­личных прокариотических промоторов получе­на экспрессия в виде химерных белков большо­го числа клонированных кДНК. Предложены простые способы одностадийной очистки неко­торых химерных белков из экстрактов бактери­альных клеток путем иммуноспецифичной аф­финной хроматографии. Дж. Гермино и Д. Бастиа (1984 г.) разработали изящный метод выще - пления целевого полипептида из химерного белка. Для этого создается гибридный ген, ко­дирующий последовательно в одинаковой рам­ке трансляции N-шнцевую часть 3-галактозидазы (или другого белка, для которого имеются в достаточном количестве специфичные иммуноглобулины), внутренний фрагмент коллагена цыпленка и изучаемый белок. Такой гибрид­ный ген в составе экспрессирующего вектора направляет в Е. coli синтез «тройного» химер­ного белка, который легко выделяется из экс­тракта клеток иммуноспецифичной аффинной хроматографией. Затем этот полипептид обра­батывают коллагеназой и хроматографией вы­сокого давления выделяют индивидуальный це­левой белок. Данный подход применим для выщепления из химеры любых белков, не имею­щих коллагеноподобных последовательностей. Подобную систему предложили К. Нагаи и X. Тоджерсен, но вместо коллагеназо - специфичной последовательности они исполь­зовали тетрапептид Ile-Glu-Gly-Arg, специ­фично узнаваемый фактором коагуляции крови Ха. Фактор Ха узнает эту последовательность в составе «тройного» химерного белка и рас­щепляет его только по остатку аргинина. В ре­зультате можно достаточно просто и с высокой эффективностью получать индивидуальный эукариотический белок, соответствующий по всем свойствам природному прототипу (в част­ности, он не имеет N-концевого метионина). Данный тетрапептид редко встречается в после­довательностях белков, и поэтому разработан­ная система экспрессии-вьпцепления может быть использована для эффективной продук­ции в клетках Е. coli многих эукариотических белков. Описанный способ извлечения целевого белка из состава химерного полипептида может иметь много модификаций в зависимости от ис­пользуемой протеазы. Ограниченное применение находят эндопротеазы, расщеп­ляющие белки по определенным аминокислот­ным остаткам, но не имеющие протяженного участка узнавания. Такую протеазу можно при­менять только в том случае, если в выщепляемой целевой последовательности отсутствуют специфичные для используемого фермента ами­нокислотные остатки. Д. Гоеддел с соавторами в 1979 г. впервые добились прямого эффективного синтеза инди­видуального белка животных в клетках Е. coli. Для этого к фрагменту ферментативно синтези­рованной кДНК гормона роста человека под­строили химически синтезированную после­довательность, кодирующую первые 24 амино­кислоты зрелого белка гормона роста человека, отсутствовавшие в выбранном фрагменте кДНК. Созданный структурный ген был точно встроен в плазмиду pBR322 под контроль тан­дема ас-промоторов, содержащих SD-последовательность. Полипептид, синтезировавшийся в клетках Е. coli, несущих гибридную плазмиду, обладал физико-химическими и иммунологиче­скими характеристиками зрелого гормона роста человека. В 1980 г. эта же группа исследователей по­лучила продукцию человеческого интерферона в клетках Е. coli. С помощью химически синте­зированного линкера в векторную плазмиду под контроль сильного промотора была точно встроена кДНК лейкоцитарного интерферона а2 человека. При этом в клетках Е. coli, содер­жащих сконструированную плазмиду, выявлял­ся эффективный синтез индивидуального белка интерферона человека (от 3,6 - 107до2,5 - 108 единиц активности интерферона на 1 л культу­ры). Полученный белок, как и природный ин­терферон человека, обладал антивирусным дей­ствием, и введение его в организм мартышек предотвращало гибель этих животных после инфицирования вирусом энцефаломиокардита. Высокая продуктивность по интерферону ряда созданных штаммов Е. coli позволила дос­таточно просто решить вопрос об очистке этого белка. Использовавшийся в клинической прак­тике природный препарат, получаемый из до­норской крови, содержал лишь около 1 ин­терферона. Из штаммов-продуцентов Е. coli удалось получить лейкоцитарный интерферон а2 практически в чистом виде, что обеспечило возможность его кристаллизации. Рас­полагая такими индивидуальными высокоочищенными препаратами, можно под
робно изу­чать широкий спектр свойств интерферонов че­ловека, что и делается во многих клиниках мира. Посредством клонирования кДНК получе­ны штаммы Е. coli, продуцирующие различ­ные интерфероны человека. Имея клонирован­ный ген, можно изменить его структуру и ис­следовать, как это скажется на свойствах коди­руемого им белка. Накопление таких экспериментальных данных позволит глубже понять механизм действия интерферонов на клетки и организмы в целом и определить, ка­кие модификации необходимо ввести в струк­туру генов интерферонов с целью направлен­ного изменения их свойств. Первые попытки получить методами генетической инженерии необычные формы интерферонов уже дали ин­тересные результаты, хотя пока такие работы проводятся без какой-либо теоретической по­доплеки. По-видимому, в ближайшие годы мы станем свидетелями интереснейших открытий в данном направлении создания медицинских препаратов. В настоящее время сконструировано боль­шое число гибридных молекул, направляющих в Е. coli экспрессию клонированных последова­тельностей кДНК. Упрощение методов точного извлечения сегментов ДНК и хими­ческого синтеза олигонуклеотидов позволяет все чаще создавать гибридные гены с заданной последовательностью нуклеотидов и добивать­ся синтеза в клетках Е. coli индивидуальных эу­кариотических белков. За счет высокой копий­ности клонируемых генов и их эффективной транскрипции в бактериальных клетках удается получать интенсивный синтез полноценных биологически активных белков человека и жи­вотных. Это позволяет достаточно просто выде­лять данные белки практически в индивидуаль­ном состоянии, что в большинстве случаев не­возможно при использовании природных ис­точников. Создание микробиологических штаммов - продуцентов, позволяющих получать многие важные белки человека и животных, в первую очередь имеет огромное значение для медици­ны и ветеринарии.