| Клонирующие векторы на основе нитевидных фагов |
|
Нитевидные фаги?. coli (М13, fd, fl) наиболее подходят для этой цели. Длинные (900 нм), тонкие (7 нм) и гибкие вирионы этих фагов представляют собой кольцевую одноцепочечную ДНК длиной 6407 нуклеотидов для фага М13 и 6408 нуклеотидов для фагов fd и fl. ДНК упакована в трубочку, состоящую из 2700 копий основного оболочечного белка pVIII и закрытую на концах четырьмя или пятью молекулами каждого из четырех минорных оболочечных белков pill, pVI, pVII и pIX. Нитевидные фаги адсорбируются на F-пилях Е. coli и поэтому способны инфицировать лишь мужские (F+) бактериальные клетки. Инфекция клеток Е. coli начинается после адсорбции белка pill, входящего в состав фаговых частиц, на конце F-пили хозяйской клетки. После этого оц ДНК фага, называемая цепью, переносится в цитоплазму клетки. Бактериальные полимеразы осуществляют синтез второй цепи, образуя двухцепочечную репликативную форму фагового генома. Синтез второй цепи инициируется на расположенном в межгенной области IR. На молекулах РФ осуществляется транскрипция и последующая трансляция фаговых генов. Белок рИ вносит разрыв в цепь РФ в участке ori, также расположенном в межгенной области IR. Это приводит к репликации фаговой ДНК по модели катящегося кольца с высвобождением цепи. По завершении цикла белок рН лигирует концы образовавшейся одноцепочечной ДНК. На ранних этапах инфекции новые цепи служат в качестве матриц для образования дополнительных молекул РФ, однако по мере накопления фагового белка pV, связывающего ДНК, процесс формирования РФ тормозится. Копийность РФ составляет 200-300 молекул на клетку. Для сборки вирионов и их экспорта необходимы клеточные мембраны. Новосинтезированные оболочечные белки фага встраиваются в плазматическую мембрану. Белки рШ и pVIII синтезируются с N-концевыми сигнальными пептидами, которые отщепляются после секреции через плазматическую мембрану. С-концевые гидрофобные домены белков остаются в мембране, а N-концевые части выходят в периплазматическое пространство. Белки pi и pIV образуют мультимерный экспортный канал между внутренней и внешней мембранами. Инициация сборки и экспорта вириона происходит после взаимодействия специфической нуклеотидной последовательности (так называемый сигнал упаковки) в IR-области ДНК с комплексом pI-pIV, бактериальным тиоредок - сином и минорными оболочечными белками pVII и р! Х. Образуемые вирионы экскретируются через экспортный канал, при этом молекулы белка pV на ДНК постепенно замещаются молекулами белка pVIII. Присоединение белков pVI и pill к кощу формируемых вирионов завершает процесс их сборки. Длина вирионов зависит от величины фагового генома и может варьировать в широких пределах. Длина частиц гибридного фага увеличивается пропорционально размеру пакующейся ДНК. Образующиеся при инфекции фаговые частицы постоянно экскретируются клетками без лизиса последних, и этот процесс является энергозависимым. За одну генерацию образуется несколько сотен фагов на клетку. Скорость роста зараженных клеток на 25-50 ниже, чем неинфицированных. Поэтому при титровании нитевидные фаги образуют на бактериальном газоне мутные бляшки. При размножении нитевидных фагов в бактериальной клетке их геном одновременно присутствует в виде большого числа копий двухцепочечной кольцевой плазмиды и одноцепочечной ДНК в составе вирионов. Из одного литра инфицированной культуры получают несколько миллиграммов одноцепочечной и репликативной двухцепочечной форм фаговой ДНК. На одноцепочечной вирионной ДНК многие манипуляции по созданию гибридных молекул, разработанные для вирусных и плазмидных двухцепочечных ДНК, реализовать нельзя. Однако они с успехом применимы к репликативной форме генома нитевидных фагов, которая инфекционна в тесте трансфекции клеток Е. coli. Все это обусловило использование нитевидных фагов для создания клонирующих векторов. Наличие несущественной области в фаговом геноме является важным условием для конструирования гибридов. Однако у нитевидных фагов большинство амбер-мутаций приводит к гибели фага при непермиссивных условиях. В геноме этих фагов существует лишь межгенная область IR размером 500 нуклеотидов, во многие места которой могут быть внесены изменения без нарушения жизнеспособности фага. Репликативная форма фаговой ДНК не имеетучастков узнавания многих крупнощепящих рестриктаз. |
Новинки от КМУ
|
$22.39
$22.39 Вы экономите: $0.00 |
|
$35.50
$35.50 Вы экономите: $0.00 |
|
$35.50
$35.50 Вы экономите: $0.00 |
|
$23.99
$23.99 Вы экономите: $0.00 |
|
$22.71
$22.71 Вы экономите: $0.00 |






