Авторизация






Cмена валюты


Поиск

Рекомендуем


Клонирующие векторы на основе нитевидных фагов

Нитевидные фаги?. coli (М13, fd, fl) наибо­лее подходят для этой цели. Длинные (900 нм), тонкие (7 нм) и гибкие вирионы этих фагов представляют собой кольцевую одноцепочечную ДНК длиной 6407 нуклеотидов для фага М13 и 6408 нуклеотидов для фагов fd и fl. ДНК упакована в трубочку, состоящую из 2700 копий основного оболочечного белка pVIII и закрытую на концах четырьмя или пятью молекулами каждого из четырех минор­ных оболочечных белков pill, pVI, pVII и pIX. Нитевидные фаги адсорбируются на F-пилях Е. coli и поэтому способны инфицировать лишь мужские (F+) бактериальные клетки. Ин­фекция клеток Е. coli начинается после адсорб­ции белка pill, входящего в состав фаговых час­тиц, на конце F-пили хозяйской клетки. После этого оц ДНК фага, называемая цепью, пере­ носится в цитоплазму клетки. Бактериальные полимеразы осуществляют синтез второй цепи, образуя двухцепочечную репликативную форму фагового генома. Синтез второй цепи инициируется на располо­женном в межгенной области IR. На молекулах РФ осуществляется транскрипция и последующая трансляция фаговых генов. Белок рИ вносит разрыв в цепь РФ в участке ori, также расположенном в межгенной об­ласти IR. Это приводит к репликации фаговой ДНК по модели катящегося кольца с высвобож­дением цепи. По завершении цикла белок рН лигирует концы образовавшейся одноцепо­чечной  ДНК. На ранних этапах инфекции новые цепи служат в качестве матриц для образования дополнительных молекул РФ, од­нако по мере накопления фагового белка pV, связывающего ДНК, процесс формирования РФ тормозится. Копийность РФ составляет 200-300 молекул на клетку. Для сборки вирионов и их экспорта необ­ходимы клеточные мембраны. Новосинтезированные оболочечные белки фага встраиваются в плазматическую мембрану. Белки рШ и pVIII синтезируются с N-концевыми сигнальными пептидами, которые отщепляются после секреции через плазматическую мембра­ну. С-концевые гидрофобные домены белков ос­таются в мембране, а N-концевые части выхо­дят в периплазматическое пространство. Белки pi и pIV образуют мультимерный экспортный канал между внутренней и внешней мембрана­ми. Инициация сборки и экспорта вириона про­исходит после взаимодействия специфической нуклеотидной последовательности (так назы­ваемый сигнал упаковки) в IR-области ДНК с комплексом pI-pIV, бактериальным тиоредок - сином и минорными оболочечными белками pVII и р! Х. Образуемые вирионы экскретируются через экспортный канал, при этом моле­кулы белка pV на ДНК постепенно замещаются молекулами белка pVIII. Присоединение белков pVI и pill к кощу формируемых вирионов за­вершает процесс их сборки. Длина вирионов зависит от величины фаго­вого генома и может варьировать в широких пределах. Длина частиц гибридного фага уве­личивается пропорционально размеру пакую­щейся ДНК. Образующиеся при инфекции фа­говые частицы постоянно экскретируются клет­ками без лизиса последних, и этот процесс яв­ляется энергозависимым. За одну генерацию образуется несколько сотен фагов на клетку. Скорость роста зараженных клеток на 25-50 ниже, чем неинфицированных. Поэто­му при титровании нитевидные фаги образуют на бактериальном газоне мутные бляшки. При размножении нитевидных фагов в бактериаль­ной клетке их геном одновременно присутст­вует в виде большого числа копий двухцепо­чечной кольцевой плазмиды и одноцепочечной ДНК в составе вирионов. Из одного литра ин­фицированной культуры получают несколько миллиграммов одноцепочечной и репликативной двухцепочечной форм фаговой ДНК. На од­ноцепочечной вирионной ДНК многие манипу­ляции по созданию гибридных молекул, разра­ботанные для вирусных и плазмидных двухце­почечных ДНК, реализовать нельзя. Однако они с успехом применимы к репликативной форме генома нитевидных фагов, которая инфекционна в тесте трансфекции клеток Е. coli. Все это обусловило использование нитевидных фагов для создания клонирующих векторов. Наличие несущественной области в фаговом геноме является важным условием для конст­руирования гибридов. Однако у нитевидных фа­гов большинство амбер-мутаций приводит к ги­бели фага при непермиссивных условиях. В ге­номе этих фагов существует лишь межгенная область IR размером 500 нуклеотидов, во мно­гие места которой могут быть внесены изме­нения без нарушения жизнеспособности фага. Репликативная форма фаговой ДНК не имеет участков узнавания многих крупнощепящих рестриктаз.

 

Интересное

счетчики