Хо­тя pBR322 отвечает многим требованиям, предъявляемым к клонирующим векторам, она имеет и некоторые недостатки. Как уже отмеча­лось, при встройке фрагментов ДНК по EcoRl - месту плазмиды pBR322 гибридные клоны нельзя выявить фенотипически на средах с ан­тибиотиками. Чтобы преодолеть этот недоста­ток, была сконструирована плазмида pBR325. При ее создании использовали ДНК фага Р1Сшг, содержащего ген устойчивости к хлорамфениколу (ген хлорамфениколацетил - трансферазы - cat). Рестриктазой НаеII из фа­говой ДНК выщепляли фрагмент, содержащий ген cat. Затем нуклеазой S1 гидролизовали одноцепочечные липкие концы, образованные Нае И, и получали фрагмент с тупыми концами. Этот фрагмент лигировали с расщепленными EcoRl и обработанными S1 - нуклеазой линей­ными молекулами плазмиды pBR322. После трансформации клеток Е. coli отбирали клоны с фенотипом Арг Тсг Сшг. Полученная таким об­разом плазмида pBR325 имеет единственное место гидролиза рестриктазой EcoRl в гене cat. Встройка по этому месту нарушает ген устой­чивости к хлорамфениколу, и гибридные клоны легко выявляются по фенотипу AprTcrCms. Плазмида pBR325 в отличие от pBR322 имеет уже по два места действия рестриктаз Pvull и Ball, причем по одному из них приходится на ген cat . Остальные уникальные места узнавания рестриктаз плазмиды pBR322 сохранены и в pBR325.