| Космиды |
|
Космиды - это плазмидные векторы, в которые встроен участок генома фага Я, обеспечивающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу. Необходимыми компонентами космидного клонирующего вектора являются: плазмидный участок начала репликации ДНК и детерминанта устойчивости к антибиотику; единичное число мест гидролиза одной или несколькими рестриктазами, пригодных для клонирования фрагментов ДНК; фрагмент ДНК, содержащий ковалентно зашитые липкие концы фага Я (соя-сайт). Кроме того, космида должна иметь небольшой размер, чтобы можно было клонировать фрагменты ДНК длиной более 30 тпн. Принцип клонирования в космидах, предложенный Дж. Коллинзом и Б. Хоном (1978 г.). Лигированию подвергается смесь молекул космидной и клонируемой ДНК, гидролизованных определенной рестриктазой. При этом космида находится в высокой концентрации. Среди большого многообразия продуктов лигазной реакции образуются также молекулы, состоящие из клонируемых фрагментов ДНК, к обоим концам которых пришиты космиды так, что оба cos-сайта находятся в одинаковой ориентации и между этими cos-сайтами сосредоточена вся генетическая информация космиды. Когда такие молекулы инкубируют в реакции упаковки ДНК фага Я in vitro, cos-сайты, фланкирующие чужеродную ДНК, расщепляются фаговыми ферментами с образованием одноцепочечных липких концов, и получившиеся молекулы ДНК упаковываются в фаговые капсиды. После инфекции клеток Е. coli образовавшимися in vitro фаговыми частицами гибридные ДНК внедряются в клетки, циклизуются по липким фаговым концам, реплицируются как плазмиды и детерминируют устойчивость к определенному антибиотику. В процессе упаковки гибридных ДНК in vitro происходит отбор гибридов, суммарный размер ДНК которых составляет 38-51 тпн. Наиболее популярные космидные векторы имеют размер 4-6 тпн, поэтому в них можно клонировать фрагменты ДНК длиной от 35 до 45 тпн. Космидные библиотеки генов состоят из меньшего числа клонов, чем библиотеки на основе векторных фагов Я. Однако последние все же предпочтительнее в тех случаях, когда не требуются фрагменты размером более 20 тпн. Это связано с некоторыми техническими сложностями, возникающими при конструирован библиотек генов на основе космид. Так, оказалось, что при этом происходит лигирование векторов друг с другом , что дает высокий фон клонов, не содержащих вставок чужеродной ДНК. Кроме того, скрининг большого числа колоний бактерий проводить сложнее, чем фаговых бляшек. Клонированные крупные фрагменты в составе ДНК фага более стабильны, чем в космидах, поскольку репликон фага адаптирован к поддержанию молекул большого размера. Важно отметить, что для предотвращения встройки в космидный вектор нескольких несоседних на геноме фрагментов необходимо проводить фракционирование клонируемой ДНК или дефосфорилирование, как и в случае получения библиотек генов на основе фага Я. В настоящее время получен широкий спектр разнообразных космид, которые используют при создании библиотек генов прокариотических и эукариотических организмов. Вводя в состав космид полилинкеры, можно существенно расширять возможности этих векторов по клонированию чужеродных фрагментов. Так, космида рЛШ215 содержит участки расщепления для 16 рестриктаз. В целом можно заключить, что векторные фаги Я и космиды составляют взаимодополняющую группу векторов, пригодных для формирования библиотек и энциклопедий генов. |
Новинки от КМУ
|
$22.39
$22.39 Вы экономите: $0.00 |
|
$35.50
$35.50 Вы экономите: $0.00 |
|
$35.50
$35.50 Вы экономите: $0.00 |
|
$23.99
$23.99 Вы экономите: $0.00 |
|
$22.71
$22.71 Вы экономите: $0.00 |






