Авторизация






Cмена валюты


Поиск

Рекомендуем


Космиды

Космиды - это плазмидные векторы, в ко­торые встроен участок генома фага Я, обеспечи­вающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу. Необходимыми компо­нентами космидного клонирующего вектора яв­ляются: плазмидный участок начала репликации ДНК и детерминанта устойчивости к анти­биотику; единичное число мест гидролиза одной или несколькими рестриктазами, пригодных для клонирования фрагментов ДНК;  фрагмент ДНК, содержащий ковалентно за­шитые липкие концы фага Я (соя-сайт). Кроме того, космида должна иметь неболь­шой размер, чтобы можно было клонировать фрагменты ДНК длиной более 30 тпн. Принцип клонирования в космидах, предло­женный Дж. Коллинзом и Б. Хоном (1978 г.). Лигированию подверга­ется смесь молекул космидной и клонируемой ДНК, гидролизованных определенной рестрик­тазой. При этом космида находится в высокой концентрации. Среди большого многообразия продуктов лигазной реакции образуются также молекулы, состоящие из клонируемых фраг­ментов ДНК, к обоим концам которых пришиты космиды так, что оба cos-сайта находятся в оди­наковой ориентации и между этими cos-сайта­ми сосредоточена вся генетическая информа­ция космиды. Когда такие молекулы инкубируют в реак­ции упаковки ДНК фага Я in vitro, cos-сайты, фланкирующие чужеродную ДНК, расщепля­ются фаговыми ферментами с образованием од­ноцепочечных липких концов, и получившиеся молекулы ДНК упаковываются в фаговые кап­сиды. После инфекции клеток Е. coli образовав­шимися in vitro фаговыми частицами гибрид­ные ДНК внедряются в клетки, циклизуются по липким фаговым концам, реплицируются как плазмиды и детерминируют устойчивость к оп­ределенному антибиотику. В процессе упаков­ки гибридных ДНК in vitro происходит отбор гибридов, суммарный размер ДНК которых со­ставляет 38-51 тпн. Наиболее популярные космидные векторы имеют размер 4-6 тпн, поэто­му в них можно клонировать фрагменты ДНК длиной от 35 до 45 тпн. Космидные библиотеки генов состоят из меньшего числа клонов, чем библиотеки на ос­нове векторных фагов Я. Однако последние все же предпочтительнее в тех случа­ях, когда не требуются фрагменты размером бо­лее 20 тпн. Это связано с некоторыми техниче­скими сложностями, возникающими при конст­руирован библиотек генов на основе космид. Так, оказалось, что при этом происходит лиги­рование векторов друг с другом , что дает высокий фон клонов, не содержащих вставок чужеродной ДНК. Кроме того, скри­нинг большого числа колоний бактерий прово­дить сложнее, чем фаговых бляшек. Клониро­ванные крупные фрагменты в составе ДНК фа­га более стабильны, чем в космидах, поскольку репликон фага адаптирован к поддержанию мо­лекул большого размера. Важно отметить, что для предотвращения встройки в космидный вектор нескольких несоседних на геноме фраг­ментов необходимо проводить фракционирова­ние клонируемой ДНК или дефосфорилирование, как и в случае получения библиотек генов на основе фага Я. В настоящее время получен широкий спектр разнообразных космид, которые используют при создании библиотек генов прокариотических и эукариотических организмов. Вводя в состав космид полилинкеры, можно сущест­венно расширять возможности этих векторов по клонированию чужеродных фрагментов. Так, космида рЛШ215 содержит участки расщепле­ния для 16 рестриктаз. В целом можно заклю­чить, что векторные фаги Я и космиды состав­ляют взаимодополняющую группу векторов, пригодных для формирования библиотек и эн­циклопедий генов.

 

счетчики