Существенным недостатком «плюс-минус»-метода является то, что получить строго статистический набор продуктов ограниченно­го копирования на первой стадии очень трудно. Поэтому данный подход в 1977 г. сменился дру­гим, разработанным в той же лаборатории, воз­главляемой Ф. Сэнгером. Первоначально он по­лучил название метода терминирующих анало­гов трифосфатов (метод дидезоксинуклеозид - трифосфатов), а в настоящее время называется дидезокси-методом Сэнгера. Как и в случае «плюс-минус»-метода, в его основу положено ферментативное копирование при помощи Poll исходного одноцепочечного сегмента ДНК с точки, задаваемой положением 3-конца прай­мера. Специфическая терминация синтеза но­вых цепей ДНК обеспечивается добавлением в реакционную смесь кроме четырех типов dNTP один из которых мечен 32Р по положе­нию синтетического аналога нуклеотида - 2,3 - дидезоксинуклеозидтрифосфата (ddNTP). Poll способна включать этот аналог в растущую цепь ДНК, однако, как только включение ddNTP произошло, дальнейшее наращивание цепи пре­кращается ввиду отсутствия в ddNTP З-ОН - группы. Отношение концентраций dNTP/ddNTP под­бирается экспериментально таким образом, что­бы терминация реакции полимеризации проис­ходила вдоль копируемой цепи ДНК в среднем на каждом месте расположения нуклеотида, комплементарного использованному ddNTP. Образцы четырех реакционных смесей, содер­жащих по одному из типов ddNTP, наносят в со­седние ячейки денатурирующего полиакрил - амидного геля (ПААГ) для фракционирования и после радиоавтографии геля читают последо­вательность с радиоавтографа . Метод Сэнгера значительно упростился и получил широкое распространение после появ­ления векторной системы на основе нитевид­ного фага М13. Фаг М13 содержит в составе вирионов одноцепочечную кольцевую молеку­лу ДНК. При репликации в инфицированных клетках Е. coli молекула ДНК фага М13 прохо­дит через стадию образования двухцепочечной репликативной формы, которую можно легко выделить и встроить в нее чужеродные фраг­менты ДНК. Гибридные фаги в составе своих вирионов будут содержать одноцепочечную кольцевую молекулу ДНК, в которой в строго определенном месте находится одна из цепей встроенного фрагмента. Для секвенирования дидезокси-методом Сэнгера любой последовательности ДНК, кло­нированной в составе генома векторного фага М13, можно использовать один и тот же (универ­сальный) синтетический олишнуклеотидный праймер, комплементарный последовательности ДНК фага, прилегающей к участку встройки чу­жеродных фрагментов. При этом нет необходи­мости получать специфические праймеры для секвенирования каждого индивидуального фраг­мента. Этот остроумный прием позволил много­кратно повысить скорость секвенирования. Как правило, этим методом с использованием уни­версального праймера удается секвенироватъ последовательность размером 250-400 нуклео­тидов.