TFIIIA Xenopus является цинксодержащим металлопротеином с мол. массой 40 кДа. Его аминокислотная последовательность, состоящая из 344 остатков, была определена из данных о нуклеотидной последовательности соответствующей кДНК. Клонированный ген белка TFIIIA Xenopus имеет длину 11 т. п. н. и содержит восемь интронов. Примерно две трети аминокислот TFIIIA со стороны N-конца (остатки 13-276) образуют девять копий несовершенного повтора, состоящего примерно из 30 аминокислот, при этом каждая копия обязательно содержит два остатка цистеина и гистидина. Участки гена TFIIIA, кодирующие повторы из 30 аминокислот, разделены интронами. Весь С-концевой домен не содержит никаких повторов и кодируется одним экзоном. По данным атомной абсорбционной спектроскопии, с молекулой очищенного белка связано девять (± один) атомов цинка. Детальный рентгеноструктурный анализ с высоким разрешением показал, что каждый такой атом образует хелатные связи с парами цистеиновых и гистидиновых остатков, находящимися в одном из повторов. Наибольшее предпочтение отдается структурной модели TFIIIA, в соответствии с которой белок имеет девять цинковых пальцев в каждом из которых атом цинка координационно связан с четырьмя аминокислотными остатками (два остатка цистеина и два - гистидина). Участки между этими спаренными остатками цистеина и гистидина всегда содержат фенилаланин (или тирозин) и лейцин (или метионин) и разное число основных аминокислот. Перед каждым цинковым пальцем обязательно находится остаток тирозина или фе нилаланина, а между двумя цистеинами обычно расположен кислый остаток. Основные и другие остатки, входящие в состав пальцев, образуют ДНК-связывающий участок TFIIIA. По-видимому, TFIIIA связывается с последовательностью длиной примерно 50 п. н., входящей в ICR гена 5S-pPHK, при этом каждый из девяти цинковых пальцев контактирует с участком длиной ~ 5 п. н. Как показали опыты по определению чувствительности ДНК в составе ДНК-белкового комплекса к действию диметилсульфата и кокковой нуклеазы, контакты между TFIIIA и ДНК осуществляются через каждые 5 п. н., что равно половине витка спирали. Однако, за исключением возможной периодичности в расположении остатков гуанина, в ICR нет никаких явных повторов, которые могли бы формировать одинаковые сайты связывания для каждого из девяти пальцев. В настоящее время принята модель связывания, предполагающая, что TFIIIA взаимодействует с кластерами гуанина, располагаясь вдоль одной стороны двойной спирали (рис. 8.70). Существование таких множественных контактов позволяет объяснить стабильность комплекса TFIIIA-TFIIIC-ICR и сохранение его целостности при многократных циклах транскрипции, во время которых РНК-полимераза перемещается вдоль ДНК, отсоединяя последовательно один или несколько пальцев. Некоторые факторы транскрипции, осуществляемой с помощью РНК-полимеразы II. для связывания с родственными регуляторными последовательностями тоже используют цинковые пальцы (разд. 8.3. д и е; 8.6. а). Свой вклад в связывание вносят все цинковые пальцы, но в первую очередь два N-концевых пальца, взаимодействующих с С-боксом. Остальные пальцы контактируют с А-боксом и с участком между двумя боксами; вклад последних в энергию взаимодействия менее существен (рис. 8.61). Какие именно аминокислоты отвечают за узнавание различных элементов ICR, точно неизвестно. Участок вблизи С-конца может активировать транскрипцию, либо влияя прямо на РНК-полиме – разу III, либо взаимодействуя с TFIIIB иили TFIIIC. Известно, что TFIIIB и TFIIIC стабилизируют связывание TFIIIA с ICR, однако участвуют ли эти факторы также и в активации инициации транскрипции под действием полимеразы, неясно. Тот факт, что TFIIIB и TFIIIC могут стимулировать транскрипцию всех других генов класса III, позволяет предположить, что они принимают непосредственное участие в инициации транскрипции, катализируемой РНК-полимеразой III. �
Остается ли стабильным комплекс, образующийся в результате взаимодействия трех факторов транскрипции с ICR, во время перемещения РНК – полимеразы III в процессе транскрипции последовательности находящейся за регуляторной областью? Чтобы ответить на этот вопрос, изучали транскрипцию гена 5S-pPHK, сшитого с бактериальным промотором таким образом, чтобы последовательность 58-рДНК могла транскрибироваться in vitro с помощью очищенных препаратов бактериальной РНК-полимеразы. Было показано, что в условиях, при которых РНК-полимераза III правильно транскрибирует ген 5S-pPHK, бактериальная полимераза также эффективно транскрибирует этот ген как в присутствии, так и в отсутствие трех факторов транскрипции. После транскрипции с помощью бактериальной РНК-полимеразы 5S pPHK нормально синтезируется в присутствии одной только РНК-полимеразы III. Это говорит о том, что комплекс преинициации. содержащий 58-рДНК, TFIIIA, TFIIIB и TFIIIC, не разрушается во время транскрипции с участием бактериальной РНК-полимеразы. Существенно, что транскрипция, катализируемая бактериальной РНК-полимеразой, протекала в условиях, не обеспечивающих повторную сборку комплекса преинициации в случае его диссоциации. Если бы комплекс диссоциировал, то из-за невозможности его повторного образования до или после добавления РНК-полимеразы III синтез 5S-pPHK не осуществился бы. Хотя это до сих пор и не доказано, считается, что комплекс 58-рДНК с факторами транскрипции также не разрушается при повторных циклах транскрипции с участием РНК-полимеразы III. Благодаря тому, что область контактирования домена из девяти повторяющихся цинковых пальцев с ICR-последовательностью из 50 п. н. (рис. 8.71) достаточно протяженна, одни ДНК-белковые связи в ходе транскрипции разрушаются, а другие восстанавливаются. Иная картина наблюдается при репликации ДНК, входящей в комплекс. Эти данные были получены при введении области ori репликации ДНК SV40 в плазмиду. содержащую ген 5S-pPHK. После сборки комплекса преинициации, аналогичного рассмотренному выше, добавляли компоненты, необходимые для репликации плазмиды in vitro, а после репликации ДНК РНК-полимеразу III и проверяли, синтезируется ли 5S-pPHK. В этом случае 5S-pPHK синтезировалась только при добавлении трех факторов транкрипции, когда мог вновь образоваться комплекс преинициации. Более того, при расщеплении реплицированной ДНК под действием ДНКазы I образовывались такие же продукты, что и при расщеплении свободной ДНК; следовательно, TFIIIA и TFIIIC не были связаны с ДНК. Очевидно, комплекс 5S-pPHK с тремя факторами транскрипции разрушается во время репликации, но не во время транскрипции ДНК. Нестабильность комплекса при репликации ДНК может объясняться тем, что для успешной работы комплекса репликации должно произойти расплетание протяженных участков двойной спирали.