В 1978-1979 гг. С. Джиллам и М. Смит с со­авторами экспериментально обосновали воз­можность использования синтетических олиго - нуклеотидов в качестве мутагенов. Объектом мутагенеза авторы выбрали фаг 0X174, имеющий небольшую одноцепочечную кольцевую ДНК, для которой уже была извест­на последовательность нуклеотидов. Одноце­почечную кольцевую ДНК гибридизовали с синтетическим олигонуклеотидом, имевшим определенные отличия от соответствующей по­следовательности фагового генома, например точечную замену одного из нуклеотидов. Дан­ный олигонуклеотид использовали в качестве праймера для достройки второй цепи на ДНК - матрице. Эту реакцию осуществляли с по­мощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli и ДНК-лигазы. Затем препарат ДНК об­рабатывали нуклеазой S1 для гидролиза час­тично двухцепочечных молекул фаговой ДНК и трансфицировали им сферопласты Е. coli. В процессе репликации образовывалось сме­шанное фаговое потомство, состоявшее как из фагов дикого типа, так и из мутантных. Причем мутантная форма составляла около 15 полу­ченного потомства, хотя теоретически может достигать 50 . Разработанный на модельной системе фага 0X174 метод олигонуклеотид-направленного мутагенеза получил дальнейшее развитие на других типах молекул ДНК, прежде всего на ДНК нитевидных фагов и плазмидах. У плаз­мид приходится получать одноцепочечные кольцевые формы при определенных фермент­ных обработках двухцепочечной ДНК in vitro, что обычно осуществить не очень просто. По­этому наиболее широко используют нитевид­ные фаги, и в первую очередь фаг М13. На коль­цевой одноцепочечной ДНК фага М13 удобно достраивать вторую цепь. Кроме того, создана серия векторных молекул на основе ДНК фага М13, и данный фаг с успехом используется при секвенировании клонированных последова­тельностей ДНК методом Сэнгера. Пионерские работы по олигонуклеотидна - правленному мутагенезу фага М13 и гибридов на его основе провели Дж. Мессинг с сотрудни­ками (1981-1983 гг.). Они продемонстрировали возможность вводить в геном фага с помощью олигонуклеотидов направленные замены, встав­ки, делеции. Таким путем, в част­ности, получены новые векторные производ­ные серии М13тр. Важной особен­ностью данного метода является то, что олиго - нуклеотид-мутаген может быть использован для эффективного отбора получаемых мутантных клонов. С этой целью выросшие после трансфекции клоны ДНК гибридизуют на нит­роцеллюлозе с 32Р-меченным синтетическим олигонуклеотидом-мутагеном при низкой тем­пературе, а затем осуществляют последователь­ные отмывки радиоактивного зонда при повы­шении температуры с интервалом в 5 °С, радио - автографируя фильтр после каждой обработки. В результате таких процедур можно подобрать условия, когда радиоактивно меченный олигонуклеотид будет гибридизоваться только с пол­ностью комплементарной (мутантной) после­довательностью, но не с ДНК, имеющей отли­чие хотя бы по одному нуклеотиду (дикий тип). Данный методический прием очень широко ис­пользуют при введении направленных мутаций и отборе целевых вариантов. Недостатком классического варианта олиго­нуклеотид-направленного мутагенеза ДНК фа­га Ml 3 являлось то, что выход гибридов обыч­но не превышал 5 . Поэтому требовалось по­добрать условия, которые позволили бы при­близиться к уровню 50 , а может быть, и пре­высить его. Короткие олигонуклеотиды весьма чувстви­тельны к действию разных нуклеаз, а также экзонуклеазных активностей ДНК-полимеразы I Е. coli, поэтому возникает проблема защиты синтетических олигонуклеотидов-мутагенов. В лаборатории В. А. Петренко предложили вместо обычных олигодезоксирибонуклеотидов использовать их неприродные фосфотри - эфирные аналоги. Показано, что они сохраняют способность специфически связываться с комп­лементарными участками ДНК и служить праймерами в ДНК-полимеразной реакции. Приме­нение триэфирных аналогов олигонуклеотидов позволило в ряде случаев поднять уровень му­тагенеза с 1-2 до 10 . При этом можно было использовать природную форму ДНК-полиме­разы I. Poll осуществляет синтез второй цепи ДНК не очень эффективно, поэтому полностью до­строенные двухцепочечные ДНК фага М13 об­разуются с невысокой частотой. Ряд авторов предложили применять двойное праймирование или использовать кольцевую двухцепочечную ДНК с одноцепочечной брешью. В этом случае полностью двухцепочечные мо­лекулы ДНК.