Механизм удаления интронов в тРНК лучше всего изучен у дрожжей, но некоторая информация получена в опытах с другими низшими эукариотами и растениями. Известны и выделены в высокоочи - щенном виде все ферменты сплайсинга, охарактеризованы все промежуточные формы. Специфическая тРНК-эндонуклеаза расщепляет про-тРНК в 5′-сочленении интрона с образованием циклического 2′,3′-фосфодиэфира на конце 5′-половины тРНК. Тот же фермент расшепляет другое сочленение интрона с образованием 5′-гидроксильной группы на конце З’-половины тРНК. Эти реакции напоминают расщепление под действием некоторых РНКаз. Циклический фосфодиэфир на конце 5′-экзона затем отщепляется с образованием 2′-фосфомоноэфира под действием циклической фосфо – диэстеразы. После фосфорилирования 5′-гидрок - сильного конца З’-экзон аденилируется при помощи тРНК-специфичной лигазы; последняя реакция аналогична реакциям, катализируемым ДНК-лигазой. После лигирования активированных концов двух частей молекулы образуется необычная 2′-фосфат-3′,5′-фосфо иэфирная связь, и затем при отщеплении 2′-фосфата под действием фосфатазы получается зрелая молекула тРНК. Заметим, что фосфат, участвующий в образовании новой диэфир ной связи, до этого входил в состав АТР-особенность, отличающая сплайсинг тРНК у дрожжей от аналогичного процесса у позвоночных (рис. 8.89,?). В данной цепи реакций первоначальное эндонуклеазное расщепление приводит к образованию 5 - гид - роксильного и 3 - фосфомоноэфирного концов, причем последний преврашается в циклическии 2′,3′-фосфодиэфир под действием АТР-зависимой циклазы. Затем тРНК-специфичная лигаза соединяет обе части без дополнительной активации концов. Альтернативный сплайсинг: множественные белки одного гена �
При сплайсинге большей части про-мРНК каждый интрон вырезается в соответствующих 5′- и З’-сайтах сплайсинга. В результате все экзоны и порядок их расположения в транскрипте сохраняются в зрелой мРНК и образуют непрерывную последовательность (конститутивный сплайсинг). Однако сплайсинг некоторых про-мРНК протекает по-разному с образованием семейства близких по строению мРНК, каждая из которых состоит из специфического набора экзонов и кодирует одну из изоформ белков одного семейства. Такой способ процессинга РНК называется альтернативным сплайсингом. Растет число генов из разных организмов, от Drosophila до человека и их вирусов, о которых известно, что при созревании их про - мРНК используется альтернативный сплайсинг. Эти гены кодируют многие белки, в том числе некоторые белки, участвующие в формировании цитоскелета, мышечном сокращении, сборке мембранных рецепторов, пептидных гормонов, в промежуточном метаболизме и транспозиции ДНК. Альтернативный сплайсинг позволяет получать разные продукты от одного-единственного гена без изменения его геномной организации. Он представляет собой эффективный способ продуцирования мРНК, кодирующих структурно родственные белки, в которых одинаковые аминокислотные последовательности определяются общими экзонами, а индивидуальные последовательности-экзонами, участвующими в альтернативном сплайсинге. В некоторых случаях разные мРНК при альтернативном сплайсинге образуются одновременно, при этом отдельные изоформы белка могут выполнять как одинаковые, так и разные функции. Все четыре изоформы основного белка миелина являются компонентами миелиновых оболочек нейронов центральной нервной системы; иммуноглобулины представлены двумя изоформами - мембраносвязанной и секретируемой. Сплайсинг некоторых транскриптов генов в разных тканях протекает по-разному; например, при экспрессии единственного гена кальцитонина в щитовидной железе синтезируется кальцитонин, а в мозгу его изоформа - белок, родственный кальцитонину; при этом каждый белок синтезируется на своей собственной мРНК, образующейся в результате дифференциального сплайсинга. В некоторых системах генов (в качестве примера можно привести ген тропонина Т млекопитающих и комплекс ultrahithorax у Drosophila) относительное содержание и типы мРНК, образующихся в результате альтернативного сплайсинга, регулируются в процессе развития. Альтернативный сплайсинг играет важную роль в становлении пола во время эмбриогенеза Drosophila. Так, разная активность регуляторных генов у самцов и самок обусловлена в большей степени специфическими половыми различиями в сплайсинге РНК, которые ведут к образованию функционально разных транскриптов у разных полов. Более того, отдельные гены в этой регуляторной иерархии не только самостоятельно контролируют свою активность на уровне сплайсинга, но и определяют способ сплайсинга транскриптов, функционирующих позднее, на следующих этапах.